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分光光度法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線常見問題解決方法

點擊: 次 時間:2016-08-04 10:12

一、標(biāo)準(zhǔn)曲線

 分析檢測中繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的目的是可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出待測物質(zhì)的含量,所以標(biāo)曲的制定是實驗室工作中必不可少的工作。

 很多用戶對于標(biāo)準(zhǔn)曲線有很多疑問,例如做標(biāo)準(zhǔn)曲線真的那么簡單?你的標(biāo)曲真的做好了嗎?導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)曲線彎曲的原因是什么?RSD值、線性相關(guān)系數(shù)和線性方程如何?線性好與不好分別由于哪些原因造成的?是儀器、標(biāo)液,還是配制的問題?

 首先說明下前期測定時注意事項:

1、儀器校驗好。

2、移取液體體積要精確,保證迅速準(zhǔn)確,盡可能用一根移液管;為減小人為誤差,同一種液體要一個人操作。

3、保證標(biāo)準(zhǔn)品的純度,所用標(biāo)準(zhǔn)品最好是新打開的,純度較高的固體或溶液,防止污染。

4、容器要保證潔凈。

5、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品理化性質(zhì)注意加樣的先后順序。

6、如果要測OD值,應(yīng)保證測前各管液體充分混勻。

7、若還是有某個點誤差較大,應(yīng)舍棄。

    其次,還要了解如下知識:

1.樣品的濃度等指標(biāo)是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出來的,所以首先要把做標(biāo)準(zhǔn)曲線看作是比做正式實驗還要重要的一件事,否則后面的實驗結(jié)果無從談起。

2、設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的標(biāo)準(zhǔn)濃度范圍要有一個比較大的跨度,并且要能涵蓋你所要檢測實驗樣品的濃度,即樣品的濃度要在標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍之內(nèi),包括上限和下限。而對于呈s型的標(biāo)準(zhǔn)曲線,盡量要使實驗樣品的濃度在中間坡度最陡段,即曲線幾乎成直線的范圍內(nèi)。

3、最好采用倍比稀釋法配制標(biāo)準(zhǔn)曲線中的標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度,這樣就能夠保證標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度不會出現(xiàn)較大的偏離。

4、檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品時,應(yīng)按濃度遞增順序進行,以減少高濃度對低濃度的影響,提高準(zhǔn)確性。

5、標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品數(shù)一般為7個點,但至少要保證有5個點。

6、做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)因?qū)嶒炓蟛煌兴儎?,但一般來說,相關(guān)系數(shù)r至少要大于0.98,對于有些實驗,至少要0.99甚至是0.999.

二、分光光度?法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線所遇問題

1、單色光純度不夠

問題:標(biāo)準(zhǔn)曲線上端向下彎曲。

措施:光度法中要求在最大吸收峰處測定吸光度,光度計的有效譜帶寬度越窄越好,有利于獲得純度高的單色光。

2.比色皿的厚度或光學(xué)性能不一致

如果裝試劑空白液的比色皿較其它比色皿薄或?qū)獾奈蘸头瓷渖僖恍?,則曲線的延線與縱坐標(biāo)相交;反之,與橫坐標(biāo)相交。

3.顯色反應(yīng)和反應(yīng)條件的問題

當(dāng)顯色反應(yīng)的靈敏度不高時,被測物低于某一濃度就不能顯色,當(dāng)濃度不同時,溶液對光的吸收、散射的程度不同,低濃度段往往彎曲,加上濃度高時部分膠體顆粒的聚沉,致使測定的吸光度降低,曲線上端向下彎曲。

4.操作上的原因

問題:褪色反應(yīng),顯色溶液的顏色不穩(wěn)定、易褪色,若比色時間超過了穩(wěn)定時間,標(biāo)準(zhǔn)系列中高濃度溶液顏色減褪,致使曲線上端向下彎曲。

措施:控制好顯色劑的加入時間,可以每加3份,停3~3min,再加上3份,依次進行,以使每支比色管的顯色時間相近。

5、干擾物質(zhì)的影響

三、標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢驗

標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢驗是實際操作中最大的難點,也是工作中誤區(qū)和爭議最多的話題,下面了解下最重要的三大檢驗項目:

1.精密度檢驗

標(biāo)準(zhǔn)曲線的精密度檢驗:精密度檢驗就是看試驗點距離擬合的直線的距離有無異常,所以也稱線性檢驗(擬合檢驗),需用F檢驗,P<0.05作為線性檢驗合格的標(biāo)準(zhǔn)。

2.截距檢驗

3.斜率檢驗

標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距檢驗和斜率檢驗分別考察Y=a+bX中a和b與0的統(tǒng)計學(xué)差異,a與0有差別說明有試劑空白或系統(tǒng)誤差,而b若與0沒差別說明儀器的靈敏度根本達不到分析要求。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢驗應(yīng)該是線性檢驗結(jié)合失擬檢驗,以及殘差的正態(tài)性檢驗結(jié)合才是統(tǒng)計學(xué)上比較完備的。

(內(nèi)容參考實驗與分析網(wǎng))

 


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